Electroforese en xel de poliacrilamida

A electroforese en xel de poliacrilamida (ou PAGE, do inglés polyacrylamide gel electrophoresis) é unha técnica amplamente usada en bioquímica, química forense, xenética, bioloxía molecular e biotecnoloxía para separar macromoléculas biolóxicas, xeralmente proteínas ou ácidos nucleicos, segundo a súa mobilidade electroforética. A mobilidade electroforética é función da lonxitude, conformación e carga da molécula. A electroforese en xel de poliacrilamida é unha ferramenta poderosa usada para analizar mostras de ARN. Cando o xel de poliacrilamida é desnaturalizado despois da electroforese, pode obterse información sobre a composición da mostra de especies de ARN.^[1] Existen principalmente dous grandes tipos de electroforese en xeles de poliacrilamida, que son: PAGE nativa (non desnaturalizante) e SDS-PAGE (desnaturalizante).

A poliacrilamida fórmase a partir da acrilamida. A hidratación de acrilonitrilo ten como resultado a formación de moléculas de acrilamida (C₃H₅NO) pola nitrilo hidratase.^[2] A acrilamida é tóxica para o sistema nervioso humano, polo que deben seguirse todas as medidas de seguridade cando se traballa con ela. Antes da adición de auga o monómero de acrilamida é un po, pero é soluble en auga, polo que engadindo auga se polimeriza formando a poliacrilamida.^[2] Ao facer xeles de poliacrilamida por medio da hidratación da acrilamida pode regularse o tamaño dos poros do xel. Un incremento das concentracións de acrilamida causa unha diminución do tamaño do poro do xel resultante da polimerización. O xel de poliacrilamida con poros pequenos é de grande axuda para examinar mellor moléculas máis pequenas, xa que as moléculas pequenas poden entrar nos poros e viaxar a través do xel, mentres que as moléculas grandes quedan atrapadas nas aberturas dos poros.

Como en todas as formas de electroforese en xel, as moléculas poden facerse "correr" no xel no seu estado nativo, conservando as estruturas de orde elevda das moléculas. Este método denomínase PAGE nativa. Alternativamente, pode engadirse un desnaturalizante químico para eliminar estas estruturas e converter a molécula nunha molécula sen estrutura cuxa mobilidade depende só da súa lonxitude (porque os complexos proteína-SDS teñen todos unha proporción masa-carga similar). Este procedemento chámase SDS-PAGE ou electroforese en xel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico. A SDS-PAGE é un método de separación de moléculas baseado nas diferenzas nos seus pesos moleculares. Ao pH ao cal se realiza a electroforese en xel as moléculas de SDS están cargadas negativamente e únense a proteínas nunha proporción establecida de aproximadamente unha molécula de SDS por cada dous aminoácidos.^[3] Deste modo, o deterxente dálle a todas as proteínas unha proporción uniforme carga-masa. Ao unirse ás proteínas o deterxente destrúe as súas estruturas secundaria, terciaria e cuaternaria, desnaturalizándoas e converténdoas en cadeas polipeptídicas aproximadamente liñais cargadas negativamente. Cando se someten a un campo eléctrico na PAGE, as cadeas polipeptídicas cargadas negativamente viaxan cara ao ánodo con diferente mobilidade. A súa mobilidade ou distancia á que viaxan as moléculas é inversamente proporcional ao logaritmo do seu peso molecular.^[4] Comparando a proporción relativa da distancia viaxada por cada proteína coa lonxitude do xel (Rf) poden extraerse conclusións sobre o peso molecular relativo das proteínas, nas que a lonxitude do xel é determinada pola distancia viaxada por unha pequena molécula usada como tinguidura de control (tracking dye).^[5]

Para os ácidos nucleicos, o desnaturalizante máis comunmentre usado é a urea. Para as proteínas úsase o dodecil sulfato sódico (SDS), que é un deterxente aniónico aplicado ás mostras proteícas para cubrir as proteínas e facer que incorporen dúas cargas negativas con cada molécula de SDS unida en cada dous aminoácidos da proteína desnaturalizada.^[6] O 2-mercaptoetanol pode tamén utilizarse para distorsionar as pontes disulfuro establecidas entre os complexos proteicos, o que axuda a desnaturalizar mellor a proteína. Na maioría das proteínas, a unión de SDS á cadea polipeptídica causa unha distribución homoxénea da carga por unidade de masa, o que ten como resultado o fraccionamento polo seu tamaño aproximado durante a electroforese. As proteínas que teñen un maior contido hidrofóbico (por exemplo, moitas proteínas de membrana, e aquelas que interaccionan con surfactantes no seu ambiente nativo) son intrinsecamente máis difíciles de tratar axeitadamente usando este método, debido á maior variabilidade na proporción de SDS unido.^[7] Procedimentalmente, poden usarse xuntas a PAGE nativa e a SDS-PAGE para purificar e separar as diversas subunidades dunha proteína. A PAGE nativa mantén a forma oligomérica intacta e mostrará unha banda no xel que é representativa do nivel de actividade. A SDS-PAGE desnaturaliza e separa a forma oligomérica nos monómeoros que a constitúen, mostrando bandas que son representativas dos seus pesos moleclares. Estas bandas poden utilizarse para identificar e avaliar a pureza da proteína.^[6]

1. ↑ Petrov, Alexey; Tsa, Albet; Puglisi, Joseph D. (2013-01-01). "Analysis of RNA by Analytical Polyacrylamide Gel Electrophoresis". Methods in Enzymology. Methods in Enzymology 530: 301–313. ISBN 9780124200371. ISSN 0076-6879. doi:10.1016/B978-0-12-420037-1.00016-6. 
2. ↑ ^{2,0 2,1} "Polyacrylamide". Britannica Online Academic Edition. Encyclopedia Britannica, Inc. 2017. 
3. ↑ Ninfa, Alexander; Ballou, David; Benore, Marilee (2010). Fundamental laboratory Approaches for Biochemistry and Biotechnology. United States: Wiley. pp. 164–179. ISBN 978-0-470-08766-4. 
4. ↑ Kindt, Thomas; Goldsby, Richard; Osborne, Barbara (2007). Kuby Immunology. New York: W.H. Freeman and Company. pp. 553. ISBN 978-1-4292-0211-4. 
5. ↑ Kumar, Ajay; Awasthi, Abhishek (2009). Bioseparation Engineering. New Delhi: I.K. international Publishing House. p. 137. ISBN 978-93-80026-08-4. 
6. ↑ ^{6,0 6,1} Erro no código da cita: Etiqueta <ref> non válida; non se forneceu texto para as referencias de nome :0
7. ↑ Rath, Arianna and Glibowicka, Mira and Nadeau, Vincent G. and Chen, Gong and Deber, Charles M. (2009). "Detergent binding explains anomalous SDS-PAGE migration of membrane proteins". Proceedings of the National Academy of Sciences 106 (6): 1760–1765. PMC 2644111. PMID 19181854. doi:10.1073/pnas.0813167106.